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CHO细胞培养乳酸代谢异常识别与调控策略

时间:2023-09-26

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采用中国仓鼠卵巢细胞(CHO)生产重组蛋白过程中的乳酸积累是常见的现象,通过乳酸代谢可以窥探出细胞生长代谢的综合状况。

本文综述上游工艺开发过程中的乳酸积累原因与问题解决方案,同时根据细胞培养过程中乳酸检测结果提出新的观点。


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葡萄糖代谢在细胞生长、目标蛋白表达过程中具有十分重要的地位。


葡萄糖可通过糖酵解和三羧酸(TCA)循环生成ATP为细胞活动提供能量,也可通过糖代谢各类中间产物来为合成DNA、RNA、蛋白质、脂质等分子提供碳骨架,也可生成糖基化前体物质如葡萄糖胺等对蛋白质进行糖基化修饰(如图1)。

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图1:葡萄糖代谢在细胞生长表达过程中具有十分重要的地位



细胞获取ATP可通过①1摩尔葡萄糖通过磷酸化后产生丙酮酸,而后通过有氧途径TCA循环可产生高达36摩尔ATP;②1摩尔葡萄糖在无氧途径产生4摩尔ATP,丙酮酸转化为乳酸。细胞在对数生长的旺盛阶段对ATP需求较大,葡萄糖糖除了通过TCA循环获取主要的能量外还通过无氧路径生成乳酸获取能量或作为其他代谢的补充,这样在CHO细胞扩增或补料批培养(Fed-batch)前期(培养基0-7天)观察到大量乳酸产生。

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细胞进入Fed-batch稳定期后,细胞不再需要旺盛的代谢来同时满足细胞分裂和目的基因表达,单位细胞需求能量减少,乳酸转为消耗(如图2)。

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图2:典型的Fed-batch细胞生长和乳酸代谢趋势图




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图3:Fed-batch中细胞乳酸代谢异常趋势图

如图3,Fed-batch培养中当细胞密度第4天达到峰值开始进入稳定期,乳酸达到2.5 g/L后开始下降,而后培养第6天开始,细胞乳酸并不继续消耗,培养第10天后,乳酸快速增加,最后达到3.3 g/L。综合其它参数如细胞活率下降较快,频繁补碱,且此批次最后产量明显下降看出此批次乳酸代谢为异常代谢。




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图4:乳酸异常代谢发生后典型的细胞液变化




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细胞株的影响

现今广泛使用的基因随机插入CHO宿主细胞,导致宿主细胞原有的代谢体系发生改变,转染后筛选的不同克隆之间细胞代谢特性可能有较大差异,这导致在不同克隆中出现不同的乳酸代谢速率。


传质不足

细胞在传质不足时导致营养供应不足、细胞微环境溶氧不足,从而导致糖代谢不完全,造成乳酸积累,如在50ml转管、摇瓶中培养中细胞液装量过大、摇床转速不足,在生物反应器中搅拌桨过小、搅拌转速不足。


高浓度葡萄糖或谷氨酰胺

葡萄糖作为糖代谢的底物,增加底物浓度促进糖代谢,在细胞难以消耗更多能量情况下出现乳酸积累造成pH下降。

谷氨酰胺同样可通过代谢路径进入糖代谢,过量谷氨酰胺进入培养基体系造成乳酸严重积累。


铜离子缺乏

铜离子是乳酸代谢及细胞生长的关键,当培养基铜离子不足且消耗殆尽,细胞开始出现乳酸异常代谢特征。


二氧化碳累积

高二氧化碳累积造成线粒体功能下降,导致细胞需要通过乳酸生成路径获得补充能量,此种情况时常发生在大型生物反应器中。




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乳酸对于细胞并不是有毒成份或副产物,相反乳酸是细胞的营养物,在一些案例中培养基中添加乳酸可以降低铵离子积累和提高产量。


乳酸是细胞代谢的特征产物,常被用于检测细胞代谢状况,细胞代谢过程中除了乳酸外有如苹果酸、延胡索酸、柠檬酸等中间代谢产物,在一些案例中,乳酸并没有积累,细胞pH同样失控持续下降导致细胞过早凋亡。乳酸异常代谢过程的评判需要进一步结合细胞液pH变化,异常的乳酸代谢通常伴随pH下降。在一些案例中如图5,乳酸虽然累积且没有下降,但细胞液pH持续上升,蛋白表达和pH控制良好。


培养基的成分影响乳酸的代谢,除了铜离子外,添加有机酸类成分可以促进三羧酸循环,提高细胞代谢速度,同时也会减慢乳酸消耗速度,旺盛的细胞代谢,在良好传质条件下,生化数据却显示乳酸消耗较慢。在一些培养基中,乳酸作为营养物添加至补料培养基中,通过不断的补料也会出现乳酸异常积累的情况。

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图5:可能认为乳酸异常代谢的案例




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乳酸是细胞代谢的特征产物,是细胞营养物,窥探细胞代谢是否异常,除了观察乳酸异常代谢外还需要结合pH、渗透压、二氧化碳累积、糖消耗等其他生化指标及蛋白表达去综合判断。
总结了发现乳酸代谢异常后的问题查找、解决思路及解决思路的评价,加速细胞工艺开发。

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